01摘要
隨著技術的進步，遠場熒光顯微技術在圖像分辨率中取得了重大進展，在兩個橫向維度上實現了20- 30nm的近分子分辨率。然而，三維(3D)納米分辨率成像仍然是一個挑戰。 在這里，作者通過使用光學散光以納米精度確定單個熒光團的軸向和橫向位置來演示3D隨機光學重構顯微鏡 (STORM)。光可切換探針的迭代、隨機激活可實現每個探針的高精度3D定位，因此無需掃描樣本即可構建3D圖像。使用這種方法，作者在橫向尺寸上實現了20-30 nm的圖像分辨率，在軸向尺寸上實現了 50-60 nm的圖像分辨率。這一發展使我們能夠分辨納米級細胞結構的 3D 形態。
02研究介紹（節選）
由于其非侵入性和多色能力，遠場光學顯微鏡在結合熒光標記時可提供具有最小擾動和生物分子特異性的生物樣本的三維 (3D) 成像。這些優點使熒光顯微鏡成為生物學中使用最廣泛的成像方法之一。然而，衍射屏障將傳統光學顯微鏡的成像分辨率限制在橫向維度上的 200-300 nm，使許多細胞內細胞器和分子結構無法分辨。 最近，衍射極限已被超越，20 - 50 nm 的橫向成像分辨率已通過幾種“超分辨率”遠場顯微鏡技術實現，包括受激發射耗盡 (STED) 及其相關的 RESOLFT 顯微鏡、飽和結構照明顯微鏡 (SSIM)、STORM、光激活定位顯微鏡 (PALM)和其他使用類似原理的方法。
雖然這些技術提高了 2D 圖像分辨率，但解析大多數細胞器和細胞結構需要在三個維度上進行高分辨率成像。三維熒光成像最常使用共焦或多光子顯微鏡進行，其軸向分辨率通常在 500-800 nm 的范圍內，比橫向分辨率差兩到三倍。軸向成像分辨率可以通過 4Pi 和 I5M 顯微鏡提高到大約 100 nm 。此外，通過使用 4Pi 照明幾何沿軸向方向采用STED成像可以使軸向分辨率高達 30 - 50 nm，但相同的方案在橫向分辨率中并不能實現。
在這里，作者向我們展示了 3D STORM 成像，其空間分辨率比所有三個維度的衍射極限好10倍，且無需調試樣品或光束掃描。STORM 和 PALM 依賴于單分子檢測，并利用某些熒光團的光可切換特性在時間上分離大量分子的其他空間重疊圖像，從而實現單個分子的高精度定位。除了檢測到的光子數量受到限制，單個熒光染料的橫向尺寸可以實現高達 1 nm 的定位精度。在這項工作中，作者使用散光成像方法來實現 3D STORM 成像。在 3D STORM 分析中，然后通過將其圖像的測量 wx 和 wy 值與校準曲線進行比較來確定每個光激活熒光團的 z 坐標。此外，對于浸入玻璃基板上的水溶液中的樣品，所有 z 定位都重新調整了 0.79 倍，以說明玻璃和水之間的折射率不匹配。
圖 1、3D STORM 方案。(A) 單個熒光團的三維定位。(B) 作為從單個 Alexa 647 分子獲得的 z 函數的圖像寬度 wx 和 wy 的校準曲線。(C) 單分子的三維定位分布。
STORM 的 3D 分辨率受限于單個光激活熒光團在切換周期期間在三個維度上定位的精度。在這里，作者使用 Cy3 和 Alexa 647 作為激活劑和報告基因對來執行 3D STORM 成像。紅色激光 (657 nm) 用于對 Alexa 647 分子進行成像并將其停用至黑暗狀態，而綠色激光 (532 nm) 用于重新激活熒光團。在發生永久性光漂白之前，每個激活子-報告子對可以循環打開和關閉數百次，使用物鏡型全內反射熒光 (TIRF) 或落射熒光成像幾何，在每個開關循環平均可以檢測到 6000 個光子。這種可逆的開關行為提供了一種內部控制來測量定位準確性。
作為 3D STORM 的初始測試，作者將 200 nm 生物素化聚苯乙烯微球固定在玻璃表面上制備的模型樣品進行成像，然后將樣品與 Cy3-Alexa 647 標記的鏈霉抗生物素蛋白一起孵育，再用光切換探針涂覆微球。通過迭代、隨機激活光學可分辨 Alexa 647 分子的稀疏子集，獲得珠子的 3D STORM 圖像，從而確定單個分子的 x、y 和 z 坐標。在多個激活周期的過程中，許多熒光團的位置被確定并用于構建完整的 3D 圖像。當沿三個方向觀察時，微球圖像的投影近似球形，由于每個熒光團的圖像同時編碼其 x、y 和 z 坐標，與 2D STORM 成像相比，在 3D STORM 中定位每個分子所花的時間更短。
關于3D STORM應用于細胞成像，作者對綠猴腎上皮 (BS-C-1) 細胞中的微管網絡進行了間接免疫熒光成像。用一抗對細胞進行免疫染色，然后用 Cy3 和 Alexa 647 雙標記二抗。與傳統的寬視場熒光圖像（圖 2A、B）相比，3D STORM 圖像不僅顯示出分辨率的顯著提高，而且還提供了 z軸信息（圖 2B 中的顏色編碼）。從圖 2C-E中清晰可見在細胞的 x-y、x-z 和 y-z 橫截面中分布的多層微管絲。為了更定量地描述細胞成像分辨率，作者確定了細胞中的點狀物體，這些物體表現為遠離任何可辨別的微管細絲的小簇定位，而這些簇可能代表非特異性附著在細胞上的單個抗體。
圖 2、細胞中微管的三維 STORM 成像。(A) BS-C-1 細胞大面積微管的常規間接免疫熒光圖像。(B) 同一區域的 3D STORM 圖像，z 位置信息根據彩色刻度條進行顏色編碼。(C-E) (B) 中白框勾勒出的細胞小區域的 x-y、x-z 和 y-z 橫截面，顯示 5 個微管細絲。(F) 兩個微管的 z 剖面在 x-y 投影中交叉，但在 z 中相隔 102 nm，與 (B) 中箭頭指示的區域分開。
最后，為了證明 3D STORM 可以用于解析細胞中納米級結構的 3D 形態，作者對 BS-C-1 細胞中的網格蛋白涂層凹坑 (CCP) 進行了成像。CCP 是球形籠狀結構，大小約為150-200 nm，由網格蛋白和細胞膜細胞質側的輔助因子組裝而成，以促進內吞作用。為了對 CCP 進行成像，作者采用了直接免疫熒光方案，使用的是針對網格蛋白Cy3 和 Alexa 647 雙重標記的一抗。當通過常規熒光顯微鏡成像時，所有 CCP 都顯示為幾乎衍射極限的斑點，沒有可辨別的結構（圖 3A）。在丟棄z維信息的 2D STORM 圖像中，可以清楚地看到 CCP的圓形（圖 3B、D）。從 180 ± 40 nm 的 2D 投影圖像測量的 CCP 的尺寸分布在數量上與使用電子顯微鏡確定的尺寸分布一致 (32)。包括 z 維度的信息使我們能夠清楚地看到凹坑的 3D 結構（圖 3C，E - H）。圖 3C 和 3E 顯示了圖像的 x-y 橫截面，取自細胞表面凹坑開口附近的區域。凹坑外圍的圓形環狀結構顯示出較高的分辨率。凹坑的連續 x-y 和 x-z 橫截面（圖 3F-H）清楚地揭示了這些納米級結構的三維半球籠狀形態，這在 2D STORM 圖像中是無法觀察到的。總之，作者通過 STORM 顯微鏡展示了具有 20-30 nm 橫向分辨率和 50-60 nm 軸向分辨率的 3D 超分辨率成像。這種成像能力允許在環境條件下以光學方式解析細胞結構的納米級特征，其分辨率以前只能用電子顯微鏡才能看到。
圖 3. 細胞中網格蛋白包被的凹坑的 3D STORM 成像。(A) BS-C-1 細胞區域中網格蛋白的常規直接免疫熒光圖像。(B) 同一區域的 2D STORM 圖像，包括不同 z 位置的所有定位。(C) 同一區域的 x-y 橫截面 (z 中厚 50 nm), 顯示質膜處 CCP 外圍的環狀結構。(D, E) 2D STORM (D) 中兩個附近 CCP 的放大圖及其 3D 圖像 (E) 中 100 nm 厚的 x-y 橫截面。(F - H) CCP 的串行 x-y 橫截面（z 方向每個 50 nm 厚）（F）和 x-z 橫截面（y 方向每個 50 nm 厚）（G），以及 x-y 和 x-z 橫截面3D 透視圖 (H)，顯示坑的籠狀結構。
03超高分辨率顯微成像系統iSTORM
寧波力顯智能科技有限公司(INVIEW)現已發布的超高分辨率顯微成像系統 iSTORM，采用了源自諾貝爾化學獎原理的 STORM 超高分辨率顯微成像技術, 實現了光學顯微鏡對衍射極限的突破，使得在 20 nm的分辨率尺度上從事生物大分子的單分子定位與計數、亞細胞及超分子結構解析、生物大分子生物動力學等的研究成為現實，從而給生命科學、醫學等領域帶來重大突破 。
圖4、力顯智能自主研發的超高分辨率顯微成像系統iSTORM
超高分辨率顯微成像系統 iSTORM 具有 20 nm超高分辨率、3通道同時成像、3D同步拍攝、實時重構、2小時新手掌握等特點，已實現活細胞單分子定位與計數，并提供熒光染料選擇、樣本制備、成像服務與實驗方案整體解決方案， 以納米級觀測精度、高穩定性、廣泛環境適用、快速成像、簡易操作等優異特性，獲得了超過50家科研小組和100多位科研人員的高度認可。
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參考文獻：
Huang B, Wang W, Bates M, Zhuang X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 2008 Feb 8;319(5864):810-3. doi: 10.1126/science.1153529. Epub 2008 Jan 3. PMID: 18174397; PMCID: PMC2633023.
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寧波力顯智能科技有限公司（INVIEW）是專業從事超高分辨率顯微技術和產品研發的科技企業，依托復旦大學的自動控制、新一代信息技術及香港科技大學的生物、光學、圖像處理等的技術，擁有光學、生物、自控、機械、信息技術等多領域交叉學科技術團隊，將2014年諾貝爾化學獎技術產業化，推出了超高分辨率顯微成像系統iSTORM、細胞智能監控助手Cellaview等一系列產品，幫助人們以前所未有的視角觀察微觀世界，突破極限，見所未見。
