iSTORM 可以實現單分子定位于計數，通過定位與計數可以實現對亞細胞結構以及大分子復合

物結構的解析以及生物動力學的分析。iSTORM 也整合了 SPT 的功能，具體的應用可以參考我們的產品手冊

STORM 的原理實質是通過時間換空間的方式實現了對衍射極限的突破，時間分辨率相對不高。通常情況下做活細胞超高不容易，但我們力顯智能的 iSTORM 已經實現了活細胞的超高拍攝。

另外，我們的系統還可以實現單顆粒追蹤（Single Particle Tracking, SPT）。在分子密度不高的情況下，可以實現單個分子或者納米尺度顆粒在活細胞內的追蹤。可用于分子生物學機制、生物學過程的研究以及藥物篩選。

iSTORM 使用的染料需要在緩沖液的配合下具有光切換的性質，例如熒光染料 Alexa 系列中的幾種，Atto 系列中的幾種；特定的熒光蛋白；量子點；或者其他經過處理、測試后具有光切換性質的染料等；

共聚焦實驗中使用的染料需要具有穩定發光、不易光漂白、亮度高的性質；

因而適用于 STORM 和共聚焦的染料各有不同；

力顯在此領域有豐富的技術經驗，使用力顯的整體解決方案，可以快速、高成功率的獲得實驗

結果。

跟共聚焦比簡單來說：兩點我們不能做 1.不能層掃 2.不能活細胞長時間連續拍攝，其它共聚

焦能做的我們都能做。

iSTORM 可以提供比共聚焦高 10 倍的空間分辨率，可以提供樣品內單分子的定位、計數、軌

跡追蹤等信息；

iSTORM 的成像速度比共聚焦慢，但是目前力顯的活細胞 STORM 成像可以做到幾秒鐘完成一

張超高圖片的拍攝，同時正在研發的基于深度學習的空間分辨率提升技術可以將成像時間進一步縮短，有望達到共聚焦的水平；

iSTORM 的樣品制作需要一些經驗，使用的染料需要在緩沖液的配合下具有光切換的性質，并

且需要與硬件拍攝、數據處理進行配合，從而得到超分辨率圖像，因而使用上有一些門檻，但是力顯在此領域有豐富的技術經驗，使用力顯的整體解決方案，可以快速、高成功率的獲得實驗結果。

超高是指突破了衍射極限的光學顯微成像系統。由于光存在衍射極限，無論顯微鏡做的如何精

密，一般在 xy 平面 200nm 以下的結構就看不清了。

我們的超高分辨率顯微鏡采用的是隨機光學重構的原理，利用熒光染料在激光的作用下可以出現亮暗態切換的特性，在某個時間點，一個熒光分子衍射尺度內其他分子都是暗的時候，拍照可以把它記錄下來。這些分子的光斑符合高斯分布，通過高斯擬合可以把中心點識別出來。下一個時間點拍照可能是其他分子被記錄下來。由于這些染料的閃爍是隨機不同步的。重復這一過程成千上萬次，就可以把所有的熒光染料記錄下來中心點識別出來。利用這些中心點進行重構就得到了突破衍射極限的圖像。這就是隨機光學重構（STORM）超高的分辨率顯微鏡的原理。

共聚焦可分為激光掃描共聚焦以及轉盤共聚焦，都是只采集聚焦平面的光來提升信噪比。僅靠這種方式不能提升空間分辨率，突破不了衍射極限。有些共聚焦結合了反卷積技術，可以提升一倍左右的分辨率，達到 100 多納米，有廠家也把這類共聚焦宣傳為超分辨共聚焦。這個經典意義的超高分辨率顯微成像是有差異的。

技術無法對比，需要根據具體應用場景具體分析，STORM空間分辨率高，SIM時間分辨率高。

具體損傷不好量化，但iSTORM可以進行活細胞成像.

抗體 病毒 核糖體。

扁平細胞更適合，但是不絕對，厚的細胞或者組織切片也可以拍超高。

（1）照明鎖定系統的照明部分：使用功率1w，波長455nm的科勒照明系統，明場照明波段與熒光照明波長和成像波段不重合；

（2）照明鎖定系統的玻片部分：使用融化在玻片上的塑料小球，保證和樣品之間沒有相對移動；

（3）照明鎖定系統的鎖定部分：采用PI壓電陶瓷平臺，精度1nm，位移范圍200um，實現精確校正樣本漂移量。

iSTORM超高TIRF系統是將波長為561nm、647nm、750nm的激光光纖接入TIRF模塊，通過步進電機驅動器調節激光位置，實現激光照明光路Epi、HILO和Tir三種照明，在Tir處精調驅動器找到最佳成像位置。

所使用相機主要參數：sCMOS四百萬像素，2048x2048，pixel6.5um，成像有效面積13.3x13.3mm，幀率30fps，極限幀率100fps（搭配PCIe），量子效率82%@560nm。

水平方向20nm，垂直（z）方向50nm，三通道每個區域像素：738x345，每個通道視野范圍：48x22um，垂直（z）方向成像范圍1000nm。

力顯智能科技的iSTORM超高顯微鏡可實現3通道同時成像，分別是561、656、750三個通道，每通道激光照明功率不低于150mW，可實現0~100%調節。

力顯智能科技的iSTORM超高顯微鏡系統包含以下模塊：顯微鏡主體、三色成像系統、TIRF系統、激光和控制器系統、成像工作站。

可以的，可以使用商用顯微鏡的鎖焦系統，z方向鎖焦精度在20-50nm；使用力顯三維鎖定系統，z方向鎖定精度可以達到5nm。

算法經過優化后，iSTORM超高圖像可以實現實時重構，立等可得。

使用物理鎖定的方式，實時追蹤樣品上的一個基準點的位置，并根據此移動樣品位置，補償樣品漂移。因為基準點可以在樣品制備之前加入，并且在成像過程中亮度保持穩定，所以不會增加樣品制備的復雜性，可以在整個成像過程中保持樣品位置穩定在1nm左右。

根據樣品及結構的不同，成像時間也不同。結構比較復雜的固定細胞可能要幾分鐘到十幾分鐘，活細胞成像最快可以幾秒鐘完成。

使用配置中的緩沖液和染料及照明光配合，可以使樣品上標記的熒光染料“閃爍”，使得原始圖像上可以獲得單分子的熒光染料圖像，之后通過單分子定位原理，對每個亮點進行位置擬合，并記錄在超高成像結果中。單個熒光點的定位精度與拍攝中獲得的熒光點光子數目有關系，一般情況下可以將分辨率提升10倍。

可以先用寬場成像，對樣品整體進行快速掃描，找到目標細胞后進行超高成像。

針對固定的細胞我們有專用的雙通道和三通道成像緩沖液試劑盒，進行單獨售賣。

正常情況下，以雙通道為例，曝光時間30ms, 一邊拍以便進行實時重構，拍攝10000幀需要8--10min左右。如果先拍照后分析，曝光時間10ms為例，拍攝10000幀需要1min40s左右。

樣品最好是染色完成后,及時進行拍照，樣本來不及拍照可以避光保存在4℃，保存時間不超過3天。

由于力顯智能科技的iSTORM產品所具備的20nm超高分辨率、2-3通道同時成像、界面友好、簡單易用、系統穩定性好、環境適應性高等綜合特點和優勢，使得它能夠幫助到更多科學家進行衍射極限尺度以下的生物分子組織與相互作用等的尖端科學研究，已為包括香港科技大學、香港大學、中山大學、深圳大學、北京大學醫學院等在內等超過50家科研小組和100位科研人員的科學研究的提供幫助，并獲得了高度認可。

iSTORM技術采用在特定成像緩沖液中具有光切換特性的有機染料。理論上，與激光器波長兼容的光切換染料均適用。但是，用戶應該嚴格測試染料的光切換特性，例如染料在成像緩沖液中的亮/暗工作周期。每個周期釋放出的光子越多、亮/暗工作周期越低、切換次數越多的染料越合適。本手冊中提供的樣品制備方案均采用Alexa Fluorò 647 和Alexa Fluorò 750這一對熒光染料，這是目前最適合iSTORM雙通道成像系統的選擇。如果實驗僅需要觀察一個目標（即單通道），Alexa Fluorò 647是首選，因為相比Alexa Fluorò 750，Alexa Fluorò 647 每個切換周期釋放出更多的光子，且具有更短的工作周期。

此外，諸如藍色吸收染料（Atto 488、Alexa 488、Atto 520）、黃色吸收染料Cy3B、紅色吸收染料（Alexa 647、Cy5、Dyomics 654、Atto680）和近紅外吸收Alexa 750等染料也都可以用來超高成像。

對生物結構進行特異性標記可通過免疫染色（直接免疫染色法或間接免疫染色法）且以光切換染料標記，也可以通過多肽或酶體（例如商業化產品SNAP-tag, CLIP-tag, 等等）標記目標蛋白。

適用于iSTORM系統的二抗已經商業化且已被廣泛使用。用戶也可以考慮對一抗、FAB片段或者納米抗體進行熒光標記，由于熒光分子距離目標蛋白更近，所以蛋白定位相比間接免疫熒光標記法更加準確。

iSTORM超高分辨率顯微鏡主要適用于實驗室、研究所及醫院的實驗與觀察。樣品廣泛適用于分子細胞生物學、神經生物學、免疫學、藥理學等領域內固定的細胞、組織、細菌、酵母和病毒的研究，iSTORM活細胞版也可以進行活細胞的相關成像。

熒光染料被激發進入發射態，之后會進入暗態（Dark state），在暗態中它們將與自由氧結合，進入漂白狀態。在漂白狀態下，染料不會再次發出熒光。如果不讓染料與自由氧結合，它將無法進入漂白狀態，一直維持在暗態。高功率的激發光可以使染料從暗態再次進入發射態。這種從亮到暗再到亮的狀態切換看起來就像是染料在“閃爍”一樣。STORM通過隨機的分批“點亮”目標分子來進行超分辨定位。這樣每個活躍的熒光集團都被分辨，它們的圖像與其他分子分開，不重疊。這樣確定了基團的準確位置，多次重復這個過程，每次隨機打開熒光基團的不同亞基，得到圖像，確定每個亞基的位置后，把以上圖像重建成一張超高分辨率圖像。