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iSTORM 可以實現(xiàn)單分子定位于計數(shù)，通過定位與計數(shù)可以實現(xiàn)對亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及大分子復(fù)合

物結(jié)構(gòu)的解析以及生物動力學(xué)的分析。iSTORM 也整合了 SPT 的功能，具體的應(yīng)用可以參考我們的產(chǎn)品手冊

STORM 的原理實質(zhì)是通過時間換空間的方式實現(xiàn)了對衍射極限的突破，時間分辨率相對不高。通常情況下做活細(xì)胞超高不容易，但我們力顯智能的 iSTORM 已經(jīng)實現(xiàn)了活細(xì)胞的超高拍攝。

另外，我們的系統(tǒng)還可以實現(xiàn)單顆粒追蹤（Single Particle Tracking, SPT）。在分子密度不高的情況下，可以實現(xiàn)單個分子或者納米尺度顆粒在活細(xì)胞內(nèi)的追蹤。可用于分子生物學(xué)機(jī)制、生物學(xué)過程的研究以及藥物篩選。

iSTORM 使用的染料需要在緩沖液的配合下具有光切換的性質(zhì)，例如熒光染料 Alexa 系列中的幾種，Atto 系列中的幾種；特定的熒光蛋白；量子點；或者其他經(jīng)過處理、測試后具有光切換性質(zhì)的染料等；

共聚焦實驗中使用的染料需要具有穩(wěn)定發(fā)光、不易光漂白、亮度高的性質(zhì)；

因而適用于 STORM 和共聚焦的染料各有不同；

力顯在此領(lǐng)域有豐富的技術(shù)經(jīng)驗，使用力顯的整體解決方案，可以快速、高成功率的獲得實驗

結(jié)果。

跟共聚焦比簡單來說：兩點我們不能做 1.不能層掃 2.不能活細(xì)胞長時間連續(xù)拍攝，其它共聚

焦能做的我們都能做。

iSTORM 可以提供比共聚焦高 10 倍的空間分辨率，可以提供樣品內(nèi)單分子的定位、計數(shù)、軌

跡追蹤等信息；

iSTORM 的成像速度比共聚焦慢，但是目前力顯的活細(xì)胞 STORM 成像可以做到幾秒鐘完成一

張超高圖片的拍攝，同時正在研發(fā)的基于深度學(xué)習(xí)的空間分辨率提升技術(shù)可以將成像時間進(jìn)一步縮短，有望達(dá)到共聚焦的水平；

iSTORM 的樣品制作需要一些經(jīng)驗，使用的染料需要在緩沖液的配合下具有光切換的性質(zhì)，并

且需要與硬件拍攝、數(shù)據(jù)處理進(jìn)行配合，從而得到超分辨率圖像，因而使用上有一些門檻，但是力顯在此領(lǐng)域有豐富的技術(shù)經(jīng)驗，使用力顯的整體解決方案，可以快速、高成功率的獲得實驗結(jié)果。

超高是指突破了衍射極限的光學(xué)顯微成像系統(tǒng)。由于光存在衍射極限，無論顯微鏡做的如何精

密，一般在 xy 平面 200nm 以下的結(jié)構(gòu)就看不清了。

我們的超高分辨率顯微鏡采用的是隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)的原理，利用熒光染料在激光的作用下可以出現(xiàn)亮暗態(tài)切換的特性，在某個時間點，一個熒光分子衍射尺度內(nèi)其他分子都是暗的時候，拍照可以把它記錄下來。這些分子的光斑符合高斯分布，通過高斯擬合可以把中心點識別出來。下一個時間點拍照可能是其他分子被記錄下來。由于這些染料的閃爍是隨機(jī)不同步的。重復(fù)這一過程成千上萬次，就可以把所有的熒光染料記錄下來中心點識別出來。利用這些中心點進(jìn)行重構(gòu)就得到了突破衍射極限的圖像。這就是隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)（STORM）超高的分辨率顯微鏡的原理。

共聚焦可分為激光掃描共聚焦以及轉(zhuǎn)盤共聚焦，都是只采集聚焦平面的光來提升信噪比。僅靠這種方式不能提升空間分辨率，突破不了衍射極限。有些共聚焦結(jié)合了反卷積技術(shù)，可以提升一倍左右的分辨率，達(dá)到 100 多納米，有廠家也把這類共聚焦宣傳為超分辨共聚焦。這個經(jīng)典意義的超高分辨率顯微成像是有差異的。

技術(shù)無法對比，需要根據(jù)具體應(yīng)用場景具體分析，STORM空間分辨率高，SIM時間分辨率高。

具體損傷不好量化，但iSTORM可以進(jìn)行活細(xì)胞成像.

抗體 病毒 核糖體。

扁平細(xì)胞更適合，但是不絕對，厚的細(xì)胞或者組織切片也可以拍超高。

（1）照明鎖定系統(tǒng)的照明部分：使用功率1w，波長455nm的科勒照明系統(tǒng)，明場照明波段與熒光照明波長和成像波段不重合；

（2）照明鎖定系統(tǒng)的玻片部分：使用融化在玻片上的塑料小球，保證和樣品之間沒有相對移動；

（3）照明鎖定系統(tǒng)的鎖定部分：采用PI壓電陶瓷平臺，精度1nm，位移范圍200um，實現(xiàn)精確校正樣本漂移量。

iSTORM超高TIRF系統(tǒng)是將波長為561nm、647nm、750nm的激光光纖接入TIRF模塊，通過步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動器調(diào)節(jié)激光位置，實現(xiàn)激光照明光路Epi、HILO和Tir三種照明，在Tir處精調(diào)驅(qū)動器找到最佳成像位置。

所使用相機(jī)主要參數(shù)：sCMOS四百萬像素，2048x2048，pixel6.5um，成像有效面積13.3x13.3mm，幀率30fps，極限幀率100fps（搭配PCIe），量子效率82%@560nm。

水平方向20nm，垂直（z）方向50nm，三通道每個區(qū)域像素：738x345，每個通道視野范圍：48x22um，垂直（z）方向成像范圍1000nm。

力顯智能科技的iSTORM超高顯微鏡可實現(xiàn)3通道同時成像，分別是561、656、750三個通道，每通道激光照明功率不低于150mW，可實現(xiàn)0~100%調(diào)節(jié)。

力顯智能科技的iSTORM超高顯微鏡系統(tǒng)包含以下模塊：顯微鏡主體、三色成像系統(tǒng)、TIRF系統(tǒng)、激光和控制器系統(tǒng)、成像工作站。

可以的，可以使用商用顯微鏡的鎖焦系統(tǒng)，z方向鎖焦精度在20-50nm；使用力顯三維鎖定系統(tǒng)，z方向鎖定精度可以達(dá)到5nm。

算法經(jīng)過優(yōu)化后，iSTORM超高圖像可以實現(xiàn)實時重構(gòu)，立等可得。

使用物理鎖定的方式，實時追蹤樣品上的一個基準(zhǔn)點的位置，并根據(jù)此移動樣品位置，補(bǔ)償樣品漂移。因為基準(zhǔn)點可以在樣品制備之前加入，并且在成像過程中亮度保持穩(wěn)定，所以不會增加樣品制備的復(fù)雜性，可以在整個成像過程中保持樣品位置穩(wěn)定在1nm左右。

根據(jù)樣品及結(jié)構(gòu)的不同，成像時間也不同。結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的固定細(xì)胞可能要幾分鐘到十幾分鐘，活細(xì)胞成像最快可以幾秒鐘完成。

使用配置中的緩沖液和染料及照明光配合，可以使樣品上標(biāo)記的熒光染料“閃爍”，使得原始圖像上可以獲得單分子的熒光染料圖像，之后通過單分子定位原理，對每個亮點進(jìn)行位置擬合，并記錄在超高成像結(jié)果中。單個熒光點的定位精度與拍攝中獲得的熒光點光子數(shù)目有關(guān)系，一般情況下可以將分辨率提升10倍。

可以先用寬場成像，對樣品整體進(jìn)行快速掃描，找到目標(biāo)細(xì)胞后進(jìn)行超高成像。

針對固定的細(xì)胞我們有專用的雙通道和三通道成像緩沖液試劑盒，進(jìn)行單獨售賣。

正常情況下，以雙通道為例，曝光時間30ms, 一邊拍以便進(jìn)行實時重構(gòu)，拍攝10000幀需要8--10min左右。如果先拍照后分析，曝光時間10ms為例，拍攝10000幀需要1min40s左右。

樣品最好是染色完成后,及時進(jìn)行拍照，樣本來不及拍照可以避光保存在4℃，保存時間不超過3天。

由于力顯智能科技的iSTORM產(chǎn)品所具備的20nm超高分辨率、2-3通道同時成像、界面友好、簡單易用、系統(tǒng)穩(wěn)定性好、環(huán)境適應(yīng)性高等綜合特點和優(yōu)勢，使得它能夠幫助到更多科學(xué)家進(jìn)行衍射極限尺度以下的生物分子組織與相互作用等的尖端科學(xué)研究，已為包括香港科技大學(xué)、香港大學(xué)、中山大學(xué)、深圳大學(xué)、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院等在內(nèi)等超過50家科研小組和100位科研人員的科學(xué)研究的提供幫助，并獲得了高度認(rèn)可。

iSTORM技術(shù)采用在特定成像緩沖液中具有光切換特性的有機(jī)染料。理論上，與激光器波長兼容的光切換染料均適用。但是，用戶應(yīng)該嚴(yán)格測試染料的光切換特性，例如染料在成像緩沖液中的亮/暗工作周期。每個周期釋放出的光子越多、亮/暗工作周期越低、切換次數(shù)越多的染料越合適。本手冊中提供的樣品制備方案均采用Alexa Fluorò 647 和Alexa Fluorò 750這一對熒光染料，這是目前最適合iSTORM雙通道成像系統(tǒng)的選擇。如果實驗僅需要觀察一個目標(biāo)（即單通道），Alexa Fluorò 647是首選，因為相比Alexa Fluorò 750，Alexa Fluorò 647 每個切換周期釋放出更多的光子，且具有更短的工作周期。

此外，諸如藍(lán)色吸收染料（Atto 488、Alexa 488、Atto 520）、黃色吸收染料Cy3B、紅色吸收染料（Alexa 647、Cy5、Dyomics 654、Atto680）和近紅外吸收Alexa 750等染料也都可以用來超高成像。

對生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行特異性標(biāo)記可通過免疫染色（直接免疫染色法或間接免疫染色法）且以光切換染料標(biāo)記，也可以通過多肽或酶體（例如商業(yè)化產(chǎn)品SNAP-tag, CLIP-tag, 等等）標(biāo)記目標(biāo)蛋白。

適用于iSTORM系統(tǒng)的二抗已經(jīng)商業(yè)化且已被廣泛使用。用戶也可以考慮對一抗、FAB片段或者納米抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記，由于熒光分子距離目標(biāo)蛋白更近，所以蛋白定位相比間接免疫熒光標(biāo)記法更加準(zhǔn)確。

iSTORM超高分辨率顯微鏡主要適用于實驗室、研究所及醫(yī)院的實驗與觀察。樣品廣泛適用于分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域內(nèi)固定的細(xì)胞、組織、細(xì)菌、酵母和病毒的研究，iSTORM活細(xì)胞版也可以進(jìn)行活細(xì)胞的相關(guān)成像。

熒光染料被激發(fā)進(jìn)入發(fā)射態(tài)，之后會進(jìn)入暗態(tài)（Dark state），在暗態(tài)中它們將與自由氧結(jié)合，進(jìn)入漂白狀態(tài)。在漂白狀態(tài)下，染料不會再次發(fā)出熒光。如果不讓染料與自由氧結(jié)合，它將無法進(jìn)入漂白狀態(tài)，一直維持在暗態(tài)。高功率的激發(fā)光可以使染料從暗態(tài)再次進(jìn)入發(fā)射態(tài)。這種從亮到暗再到亮的狀態(tài)切換看起來就像是染料在“閃爍”一樣。STORM通過隨機(jī)的分批“點亮”目標(biāo)分子來進(jìn)行超分辨定位。這樣每個活躍的熒光集團(tuán)都被分辨，它們的圖像與其他分子分開，不重疊。這樣確定了基團(tuán)的準(zhǔn)確位置，多次重復(fù)這個過程，每次隨機(jī)打開熒光基團(tuán)的不同亞基，得到圖像，確定每個亞基的位置后，把以上圖像重建成一張超高分辨率圖像。