“ 神經科學的進步與細胞成像的進展密切相關。17 世紀顯微鏡的發明首次允許在細胞水平上對人腦進行表征，并在 18 和 19 世紀出現了臨床神經病學、神經外科和精神病學。同樣，對神經退行性疾病的理解和分類也得益于 20 世紀下半葉免疫染色技術和多通道熒光成像的發展。然而，盡管取得了這些進展，衍射屏障仍然是傳統光學顯微鏡的分辨率限制，阻礙了亞細胞結構的精確表征。在傳統的熒光顯微鏡中，所有被照射的分子在衍射極限體積內同時發出信號，從而限制了最終獲取圖像的空間分辨率。 ”
近些年，超分辨率顯微鏡技術克服了這一障礙，使用不同的方法來區分位于同一衍射極限體積內的熒光分子。其中之一稱為隨機光學重建顯微鏡 (STORM)，它基于單分子定位，通過在不同時間點隨機打開衍射受限體積內的光開關熒光分子，因此它們的信號基本上不會重疊。當在空間中隔離時，可以通過定位其信號的中心位置來確定每個單獨熒光團的位置。然后從隨時間累積的眾多分子定位生成超分辨率圖像，提供 < 50 nm 的空間分辨率。
在神經科學領域，這項新技術導致了神經元軸突細胞骨架周期性結構的表征和突觸蛋白的空間組織。在這項研究中，研究者將用細胞成像技術與神經病理學技術相結合，對來自對照受試者和常見年齡相關神經退行性疾病患者的人腦樣本進行 2D、3D 和雙色 STORM。
《STochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) reveals the nanoscale organization of pathological aggregates in human brain》
NO.1研究結果（節選）
1、使用 STORM 對人腦樣本進行超分辨率成像
為了評估人腦組織的 STORM 成像，我們首先旨在解析明確其組織學結構，例如新皮質軸突束。來自對照受試者的前額葉皮層的冷凍樣本通過標準的低溫恒溫器方法切割， 并用抗神經絲一抗和與 Alexa Fluor (AF) 647 偶聯的二抗進行免疫染色。對帶有免疫染色腦切片的蓋玻片放置在配備高功率激光模塊、全內反射熒光 (TIRF) 系統和電子倍增電荷耦合器件 (EMCCD) 單光子敏感的倒置電動顯微鏡的載物臺上（圖1A )。
圖1. 使用 STORM 對人腦樣本進行超分辨率成像
STORM 在人腦切片中對神經絲 (NF) 免疫染色的皮層軸突的采集：首先獲得傳統的寬視場熒光顯微鏡圖像 (B1)，然后強烈增加激發功率以誘導熒光團閃爍，并產生數千幀圖片（B2-B5）。在每幀基礎上以亞像素精度 (B6-B9) 檢測激活的熒光分子的定位。然后使用來自所有幀的累積定位來重建超分辨率圖像（B10）。
2、人腦樣本的 3D-STORM 和雙色 STORM 成像
三維 (3D) 和多通道成像提供了對納米級結構的結構組織的深入了解成為了可能。為了在人腦切片中執行 3D-STORM，研究者使用了一種基于散光的方法 。在顯微鏡的檢測路徑中設置柱面透鏡后，從其圖像的橢圓度確定每個熒光分子的z坐標。對照受試者的前額葉皮質樣本對神經絲 (NF) 進行免疫染色，重建后，軸突以高分辨率和約 0.5 μm 的成像深度在 3D 中可視化（圖2A)。軸突束的圓柱形狀是可辨別的，并且 3D 建模軸突的縱向和橫向截面的尺寸與 2D-STORM 獲得的尺寸相似。
然后，為了評估皮層樣本的雙色 STORM 成像，研究者使用兩種檢測附近結構的一抗（突觸前和突觸后巴松管和荷馬 1 蛋白）以及與光開關熒光團 AF 647 和 AF 532 偶聯的二抗對人腦切片進行免疫染色（圖2B)。在傳統的熒光顯微鏡下，巴松管和荷馬 1 信號出現彌散和重疊，突觸間隙無法精確定義。相比之下，雙色 STORM 準確區分了由突觸間隙分隔的突觸前和突觸后蛋白簇，并定義了突觸的大小、方向和組織。有趣的是，也可以實現將傳統的寬視場熒光顯微鏡和 STORM 相結合的多通道成像，允許使用光可切換和非光可切換熒光團對大腦結構進行超分辨率成像。盡管不如雙色 STORM 特異性，但該技術提供了有關相鄰結構布局的有價值信息，例如軸突束周圍的髓鞘（圖 2C)。超分辨結構的尺寸與在相同區域使用 TEM 測量的尺寸相當（圖2B3,C3）。
圖2.人腦生理結構的 3D-STORM 和雙色 STORM 圖像
3、淀粉樣蛋白-Β 和 TAU 蛋白病的 STORM 成像
阿爾茨海默病 (AD) 是癡呆癥的主要原因。該疾病的兩個主要標志是 Aβ 肽的細胞外沉積物，其中一些構成了老年斑的核心，以及稱為神經原纖維纏結 (NFT) 的過度磷酸化 tau 蛋白 (p.Tau) 的神經元內聚集體。由于聚集體的尺寸可達 100 μm，因此保持整個病變的整體視圖對于研究大腦中的 Aβ 和 Tau 病理學至關重要，而高分辨率成像對于表征錯誤折疊蛋白質的納米級組織是必不可少的。
研究者使用 STORM 對整個老年斑和退化神經元進行了成像。來自 AD 患者的前額葉、頂葉和顳葉皮層的組織樣本針對 Aβ 和 p.Tau（磷酸 Ser202、Thr205）進行了免疫染色。獲得了~30 μm 直徑的老年斑和~15 μm 具有 NFT 的退化神經元的 STORM 圖像。雖然 Aβ 原纖維和 Tau 的成對螺旋絲不能像 TEM 一樣被識別，但 STORM 圖像提供了 Aβ 和 p.Tau 聚集體的納米級分布和尺寸的高分辨率細節（圖 3 )。神經元內 p.Tau NFT 看起來更密集，胞體中具有蜂窩狀結構，軸突中具有絲狀組織。聚集體中未染色點的存在表明包含其他成分，如蛋白質或細胞器。這些結果強調 STORM 可用于以高分辨率對 AD 患者腦樣本中的 Aβ 和 p.Tau 聚集體進行成像。
圖3.人腦生理結構的 3D-STORM 和雙色 STORM 圖像
4、路易斯病理學的 STORM 成像
帕金森病 (PD) 和路易體癡呆 (DLB) 是兩種神經退行性疾病，其特征是存在神經元內磷酸化的 α-突觸核蛋白 (p.α-syn) 免疫反應性包涵體，稱為路易體 (LB) 。LB 的結構根據它們在中樞神經系統中的定位而變化。通過免疫組織化學可以觀察到兩種主要的 LB 類型：典型的路易小體 (TLB)，其核心蒼白，周圍環繞著主要在腦干中的致密暈圈，以及較小的皮質路易小體 (CLB)，缺乏中央核心，主要在新皮質中檢測到. 也可以觀察到 p.α-syn 在稱為路易軸突 (LN) 的營養不良軸突中的積累。迄今為止，LB 的結構仍不清楚，因為傳統熒光顯微鏡的分辨率太低，無法表征其內部結構，并且 TEM 無法提供有關其蛋白質含量和組織的足夠信息。
為了使用分子染色方法在納米級表征 LB 組織，研究者對來自 PD 和 DLB 患者的腦樣本進行了 STORM 成像。用抗 p.α-syn（磷酸化 Ser129）抗體對黑質和前額葉皮層切片進行免疫染色，并獲得 TLB、CLB 和 LN 的圖像。盡管只有 STORM 圖像精確定義了它們的結構，但在常規和超分辨率成像中均觀察到 TLB 的環形外觀（圖4A）。蒼白的核心看起來沒有染色，而外圍的致密暈是由網狀 p.α-syn 構成的。同樣，CLB 的 STORM 成像揭示了傳統熒光顯微鏡無法觀察到的致密蜂窩結構（圖 4B,4C）。至于 p.Tau 聚集體，在 LB 中觀察到的未染色核心和斑點可能對應于蛋白質伙伴或被困細胞器。
圖4. PD 和 DLB 患者腦樣本中路易體的 STORM 圖像
事實上，路易體是由 100 多種蛋白質組成的多蛋白復合物，包括 p.Tau 。因此，我們使用針對 p.Tau 和 p.α-syn 的抗體對 LB 進行了雙色 STORM像，以精確定義病變的內部結構，并明確區分一種蛋白質與另一種蛋白質（圖 5A）。STORM 成像準確測量了聚集 p.α-syn 分支的寬度和在 CLB 中觀察到的未染色核心面積（圖 5B）。最后，LN 的雙色 STORM 成像揭示了神經突的內部組織，其中包含與神經絲結合的聚集 p.α-syn 核心（圖 5C )。這些 p.α-syn 聚集體的第一批 STORM 圖像為表征人類大腦中路易病理學的組成和空間組織提供了廣闊的前景。
圖5. 路易體和路易神經突的共定位和超微結構分析
NO.2研究總結
在這項工作中，研究者結合超分辨率顯微鏡和神經病理學技術來分析人腦切片。該策略以 <50 nm 分辨率表征生理結構（如軸突和突觸）的結構，并以前所未有的細節對來自神經退行性疾病患者的樣本中的 Aβ、Tau、α-突觸核蛋白和 TDP-43 病理聚集體進行成像。
迄今為止，組織中納米結構成像的主要方法依賴于透射電子顯微鏡，這是一種耗時的技術，需要具有嚴格樣品制備的超薄組織切片（50-70 nm），并限制免疫靶向多樣性和 3D 采集。相反，STORM 在樣品制備、廣闊的觀察視野、多分子標記和 3D 采集方面提供了光學熒光顯微鏡的優勢，圖像采集和重建只需幾分鐘。在這項工作中開發的用于人腦組織觀察的樣品制備工作流程既省時又易于重現。
雙色STORM允許突觸的分子結構的可視化，精確地識別前和突觸后蛋白簇和限定它們的尺寸，形態和取向。STORM 還用于對阿爾茨海默病小鼠模型中的病理性 Aβ 聚集體進行成像，其結果與我們在人類中的結果相當，無論是斑塊形態還是 Aβ 原纖維寬度，范圍從 50 到 300 nm最后，帕金森病小鼠模型中 α-突觸核蛋白聚集體的 STORM 成像允許可視化多巴胺能神經元中的 α-突觸核蛋白聚集。
通過揭示以前沒有被可視化的新結構和特征，固定人體組織樣本的 STORM 成像為更全面地了解人類大腦組織和揭示常見神經系統疾病的潛在機制打開了進一步的大門。這項技術的便利性應該為 STORM 應用程序的直接擴展開辟了人類大腦樣本的超分辨率成像，為當前神經科學的挑戰提供了有希望的新途徑。
參考文獻References
1. Codron, P., F. Letournel, S. Marty, L. Renaud, A. Bodin, M. Duchesne, C. Verny, G. Lenaers, C. Duyckaerts, J. P. Julien, J. Cassereau, and A. Chevrollier. 2021. 'STochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) reveals the nanoscale organization of pathological aggregates in human brain', Neuropathology and applied neurobiology, 47: 127-42.
力顯智能現已發布的超高分辨率顯微成像系統 iSTORM，成功實現了光學顯微鏡對衍射極限的突破，使得在20納米的分辨率尺度上從事生物大分子的單分子定位與計數、亞細胞及大分子復合物結構解析、生物大分子生物動力學等的研究成為現實，從而給生命科學、醫學等領域帶來重大突破。
