正常情況下,以雙通道為例,曝光時間30ms, 一邊拍以便進行實時重構,拍攝10000幀需要8--10min左右。如果先拍照后分析,曝光時間10ms為例,拍攝10000幀需要1min40s左右。
樣品最好是染色完成后,及時進行拍照,樣本來不及拍照可以避光保存在4℃,保存時間不超過3天。
由于力顯智能科技的iSTORM產品所具備的20nm超高分辨率、2-3通道同時成像、界面友好、簡單易用、系統穩定性好、環境適應性高等綜合特點和優勢,使得它能夠幫助到更多科學家進行衍射極限尺度以下的生物分子組織與相互作用等的尖端科學研究,已為包括香港科技大學、香港大學、中山大學、深圳大學、北京大學醫學院等在內等超過50家科研小組和100位科研人員的科學研究的提供幫助,并獲得了高度認可。
iSTORM技術采用在特定成像緩沖液中具有光切換特性的有機染料。理論上,與激光器波長兼容的光切換染料均適用。但是,用戶應該嚴格測試染料的光切換特性,例如染料在成像緩沖液中的亮/暗工作周期。每個周期釋放出的光子越多、亮/暗工作周期越低、切換次數越多的染料越合適。本手冊中提供的樣品制備方案均采用Alexa Fluorò 647 和Alexa Fluorò 750這一對熒光染料,這是目前最適合iSTORM雙通道成像系統的選擇。如果實驗僅需要觀察一個目標(即單通道),Alexa Fluorò 647是首選,因為相比Alexa Fluorò 750,Alexa Fluorò 647 每個切換周期釋放出更多的光子,且具有更短的工作周期。
此外,諸如藍色吸收染料(Atto 488、Alexa 488、Atto 520)、黃色吸收染料Cy3B、紅色吸收染料(Alexa 647、Cy5、Dyomics 654、Atto680)和近紅外吸收Alexa 750等染料也都可以用來超高成像。
對生物結構進行特異性標記可通過免疫染色(直接免疫染色法或間接免疫染色法)且以光切換染料標記,也可以通過多肽或酶體(例如商業化產品SNAP-tag, CLIP-tag, 等等)標記目標蛋白。
適用于iSTORM系統的二抗已經商業化且已被廣泛使用。用戶也可以考慮對一抗、FAB片段或者納米抗體進行熒光標記,由于熒光分子距離目標蛋白更近,所以蛋白定位相比間接免疫熒光標記法更加準確。
iSTORM超高分辨率顯微鏡主要適用于實驗室、研究所及醫院的實驗與觀察。樣品廣泛適用于分子細胞生物學、神經生物學、免疫學、藥理學等領域內固定的細胞、組織、細菌、酵母和病毒的研究,iSTORM活細胞版也可以進行活細胞的相關成像。
熒光染料被激發進入發射態,之后會進入暗態(Dark state),在暗態中它們將與自由氧結合,進入漂白狀態。在漂白狀態下,染料不會再次發出熒光。如果不讓染料與自由氧結合,它將無法進入漂白狀態,一直維持在暗態。高功率的激發光可以使染料從暗態再次進入發射態。這種從亮到暗再到亮的狀態切換看起來就像是染料在“閃爍”一樣。STORM通過隨機的分批“點亮”目標分子來進行超分辨定位。這樣每個活躍的熒光集團都被分辨,它們的圖像與其他分子分開,不重疊。這樣確定了基團的準確位置,多次重復這個過程,每次隨機打開熒光基團的不同亞基,得到圖像,確定每個亞基的位置后,把以上圖像重建成一張超高分辨率圖像。
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