“ 哺乳動物的大腦由功能多樣化的突觸類型組成，將不同的神經元群體連接成網絡，使復雜的行為和對外部和內部線索的反應成為可能。理解這種多樣性將是定義大腦連接的基礎。突觸是一種特殊的神經元細胞-細胞接觸，在整個神經元群中，不同突觸的分子組成不同，以實現異質連接模式和功能這些分子成分指導突觸發生、成熟和分化在發育和成年，突觸的分子多樣性進一步受到神經元活動和可塑性變化等過程以及分泌因子的控制。除了突觸前和突觸后的特化外，突觸間隙現在被認為是突觸的一個完整的隔間，有助于它們的結構和功能組織。”

為了繪制裂縫蛋白質組，作者采用過氧化物酶介導的接近標記方法，并將融合于辣根過氧化物酶的興奮性突觸細胞粘附蛋白SynCAM1(HRP)作為培養的皮質神經元的報告基因。該報告基因通過共聚焦顯微鏡測量標記興奮性突觸，并通過3D dSTORM超分辨率成像確定其定位于突觸間隙的邊緣區,用細胞表面的非膜生物素-酚化合物限制標記進行接近標記，用無標記定量(LFQ)質譜結合膜和突觸表面蛋白的比率HRP標記來鑒定興奮性裂解的蛋白質組學含量。鑒定了新的候選裂隙蛋白，并選擇了受體型酪氨酸蛋白磷酸酶zeta并成功驗證。作者在本文中支持了過氧化物酶介導的鄰近標記在突觸裂蛋白質組學中的強大適用性，以及它在理解健康和精神疾病和成癮等疾病的突觸異質性變化方面的潛力。

《Mapping the Proteome of the Synaptic Cleft throughProximity Labeling Reveals New Cleft Proteins》

01研究結果

1、SynCAM 1-過氧化物酶融合蛋白過氧化物酶介導的突觸間隙的鄰近標記

SynCAM1，是一種突觸細胞粘附蛋白，在發育過程和成熟突觸中只定位于興奮性突觸。將HRP或APEX2插入SynCAM1的363個氨基酸位置，位于最后一個免疫球蛋白(Ig)結構域和跨膜(TM)結構域之間。這將HRP置于SynCAM1的細胞外區域的基部，形成了一個SynCAM1-HRP融合蛋白，在這個位置插入的重組蛋白或標簽并不會改變SynCAM1的突觸定位。SynCAM1是一種單通道的1型膜蛋白，在生物發生后需要通過分泌途徑運輸到達細胞表面。為了限制過氧化物酶融合蛋白介導的生物素標記，通過分泌途徑進入細胞表面，包括突觸表面，需要一個含有極性連接物的非膜滲透的生物素-酚化合物。因此，作者選擇了biotin-AEEA-phenol，在過氧化氫存在的情況下，外源性biotin-AEEA-phenol誘導了表達SynCAM1-APEX2的HEK293T細胞表面的生物素化

圖1. 使用syncam1-辣根過氧化物酶(HRP)-融合蛋白進行過氧化物酶介導的接近度標記

2、繪制興奮性突觸裂蛋白質組

2.1 SynCAM1-HRP報告基因的亞突觸分布

此前，作者利用培養神經元中的STED和3DdSTORM超分辨率成像和腦切片中的免疫電鏡分析了內源性SynCAM1的突觸表達。這些方法確定了SynCAM1定位于興奮性、不對稱突觸的突觸裂，主要存在于突觸后膜，并在突觸后密度的邊緣被檢測到。為了分析SynCAM1-HRP報告基因的定位，作者在HRP的c端插入了一個flag標簽。用該結構物轉染培養的大鼠海馬神經元，并采用雙色三維dSTORM超分辨率成像進行分析。FLAG免疫染色檢測SynCAM1-HRP和突觸后興奮性支架蛋白Homer和3D dSTORM顯示超分辨SynCAM1-HRP位于Homer簇附近(圖2A)。SynCAM1-HRP集合的分布在PSD邊緣~100nm內，與內源性SynCAM1在培養大鼠海馬神經元中的亞突觸分布一致。這表明，基于syncam1的報告基因將HRP靶向到突觸裂隙，并在裂隙邊界區富集。

圖2. dSTORM揭示突觸SynCAM1-HRP的表達和生物素化

2.2 SynCAM1-突觸接近標記的HRP驗證

突觸裂隙是一種不被細胞膜包圍的開放的細胞隔室。這需要進一步提高突觸裂中蛋白質鑒定的特異性。一種比率過氧化物酶介導的標記方法以前曾應用于突觸裂蛋白和線粒體膜間間隙蛋白。我們的目的是實施這種比率測量方法，并比較由SynCAM1-HRP裂隙報告基因生物素化的蛋白與細胞外融合到跨膜結構域的廣泛表面表達的HRP。為了驗證這兩種報告基因在神經元中正確生成生物素化反應產物，我們使用重組AAV(rAAV)在體外14天(div)轉導到分離的大鼠皮質神經元的培養物中。RAAV允許培養的神經元進行大規模轉導，并滴定病毒顆粒以平衡高轉導效率和中等蛋白過表達。在添加過氧化氫和生物素-AEEA-苯酚后，神經元在21div處進行短暫的過氧化物酶介導的接近標記。使用中和病毒素-dylight488對生物素化產物進行染色，發現在SynCAM1-HRP表達神經元中，興奮性突觸位置的生物素-蛋白偶聯物，并有一些突觸外標記。相比之下，轉導到培養的大鼠皮質神經元中顯示了樹突上的生物素標記，但在突觸位置沒有富集。這些結果支持了SynCAM1-HRP和Membraie-HRP報告基因可以分別從興奮性突觸分裂和神經元細胞表面獲得鄰近標記的蛋白樣本，用于比率分析。

圖 3 SynCAM1-突觸接近標記的HRP驗證

02研究總結

過去的十年中，隨著超分辨率技術的整合，作者的數據通過STORM技術支持了使用突觸HRP報告基因的接近標記是識別裂隙分子組成的可靠方法，這是一個以前的生化研究不容易獲得的隔間。未來的應用可以包括測試在改變突觸結構的疾病相關條件下，突觸間隙組成的變化，這提供了證據，表明腦裂隙成分有助于暴露藥物濫用后的突觸變化，因此，裂縫蛋白的鄰近標記可能為動態裂縫在形成突觸中的作用提供有價值的見解，并為未來的蛋白質組學研究繪制這些變化提供了依據。

在本研究中，這項2014年諾貝爾化學獎的發現已在國內實現產業化。 寧波 力顯智能科技 有限公司 (INVIEW) 現已發布超高分辨率顯微系統 iSTORM ，采用3D隨機光學重構技術、高精度細胞實時鎖定技術、多通道同時成像技術等，以 納米級觀測精度 、 高穩定性 、 廣泛環境適用 、 快速成像 、 簡易操作 等優異特性，獲得了超過50家科研小組和100多位科研人員的高度認可。

參考文獻：

1. Mapping the Proteome of the Synaptic Cleft throughProximity Labeling Reveals New Cleft Proteins

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寧波力顯智能科技有限公司（INVIEW）是專業從事超高分辨率顯微技術和產品研發的科技企業，依托復旦大學的自動控制、新一代信息技術及香港科技大學的生物、光學、圖像處理等的技術，擁有光學、生物、自控、機械、信息技術等多領域交叉學科技術團隊，將2014年諾貝爾化學獎技術產業化，推出了超高分辨率顯微產品，幫助人們以前所未有的視角觀察微觀世界，突破極限，見所未見。