“ 理解納米材料與生物系統之間的相互作用對于提高納米藥物的有效性和加深對生物領域的理解起著至關重要的作用。熒光顯微鏡是一種強大的光學成像技術，可以直接觀察細胞內微環境中熒光標記納米材料的行為。然而，傳統的熒光顯微鏡，如共聚焦顯微鏡，由于光的衍射而具有有限的光學分辨率，因此無法提供直徑小于 250 nm 的納米材料的精確細節。幸運的是，超分辨率熒光顯微鏡的發展克服了分辨率的限制，能夠對納米細胞相互作用進行更全面的研究。在此，我們總結了通過各種超分辨率顯微技術研究的納米細胞相互作用的最新進展。”

為了充分了解納米材料與細胞內結構域的相互作用，必須更詳細地了解物理化學特性在決定納米材料的細胞結合、內化、加工和細胞內命運中的作用，這需要具有更高質量的多色成像技術。因此，需要能夠克服熒光顯微鏡光學分辨率限制的新方法。在過去的幾十年里，超分辨率熒光顯微鏡或突破衍射極限的熒光顯微鏡已經被開發出來，允許以超出衍射極限的更高分辨率捕獲圖像，分辨率能達到5 nm左右。特別是，在2014 年 10 月 8 日，諾貝爾化學獎授予Eric Betzig，William. E. Moerner和Stefan W. Hell的“超分辨熒光顯微鏡的發展”，將“光學顯微鏡帶入納米維度”，填補了電子顯微鏡和熒光顯微鏡的空白。

《Advances in super-resolution fluorescence microscopy for the study of nano–cell interactions》

01研究結果

1、超分辨率顯微鏡分類

超分辨率顯微鏡可大致分為兩大類：“真正的”超分辨率技術捕捉倏逝波中包含的信息并直接給出超分辨率圖像；和“功能性”超分辨率技術，使用智能實驗技術和對被成像樣本的已知限制來重建和產生確定性（利用非線性熒光團的響應）或隨機（利用熒光團的復雜時間行為）超分辨率圖像。超分辨率方法也可以通過三個著名的家族來識別，如圖 1 所示，包括（i)“結構化照明”SIM (ii) “受激發射損耗”方法STED；和(iii) “單分子定位”方法，其中單個熒光分子按順序定位，并以采集亮點方式重建圖像。其中SIM、STED、STORM、PALM、PAINT等多種超分辨率技術已成功應用于生物領域。

圖1. 超分辨率方法目錄及其用于觀察納米材料的代表性機制的說明，包括結構化照明、受激發射損耗和單分子定位

2、使用超分辨率熒光顯微鏡研究納米生物相互作用

2.1 結構照明顯微鏡（SIM）

SIM 是一種超分辨率熒光顯微鏡方法，它通過利用莫爾條紋來提高空間分辨率，該莫爾條紋包含在觀察區域中編碼的其他無法觀察的結構信息。使用特定的光柵在不同角度形成衍射圖案，從而產生包含附加信息的莫爾圖案（圖 1）。因此，當使用這些多個光柵角度（三個以上不同的角度）時，可以從樣本中提取大約兩倍的信息量。該信息可用于以數學方式重建超分辨率圖像，其橫向分辨率為 110 nm，軸向分辨率為 250 nm。即時 SIM 和非線性 SIM 等方法已經能夠實現 50 nm 的空間分辨率。SIM廣泛用于納米生物相互作用研究，由于其以每個顏色通道超過 10 Hz 的幀速率進行快速成像采集。SIM 增強的分辨率增加了納米材料與圖像中觀察到的細胞內細胞器的共定位信號。

使用共聚焦顯微鏡和 SIM 檢測 HeLa 細胞中的金屬氧化物納米粒子。他們表明，當使用 SIM 成像時，通過共聚焦顯微鏡獲得的圖像中似乎是納米顆粒和溶酶體共定位的一些區域被證明不是真正的共定位。納米顆?？赡馨谄渌そY合結構（例如，內體）中（圖 2i）。在這種情況下，SIM 能夠更準確地識別與溶酶體共定位的納米顆粒，這有助于納米藥物載體設計，該載體設計結合了 pH 觸發的藥物釋放，以實現精確的治療有效載荷遞送。

圖2. SIM 研究的納米細胞相互作用，包括納米顆粒的共定位、納米膠囊的細胞內變形和內化納米膠囊的量化

研究人員 通過使用 SIM，在 24 小時內捕獲金屬有機框架 (MOF) 進入 HeLa 細胞的過程。結果表明，由于細胞內和細胞外空間之間的介質差異，細胞外空間中的 MOF 比位于細胞內的 MOF 移動得更快（圖 2ii）。進一步研究發現，MOFs 吸收到 HeLa 細胞中既不受藥物模型（鈣黃綠素）加載的影響，也不受溫度處理過程的影響。納米粒子在內化過程中的變形特性提供了對其穩定性和細胞內潛在作用機制的深入了解。然而，使用傳統的共聚焦顯微鏡，在與生物系統相互作用時確定納米結構形態的細微變化通常具有挑戰性。 學者們探索了 SIM 以研究各種細胞系中聚合物膠囊的細胞內變形。據觀察，膠囊的變形取決于細胞系（圖 2iii），包括 HeLa、Raw264.7 和不同的 THP-1，但與膠囊的形狀（球體和棒狀）無關。這表明機械力因細胞系而異，因為 HeLa 中發生的變形百分比最高，其次是 RAW264.7 和分化的 THP-1 細胞。此外，他們精確量化了用聚合物納米膠囊區分 THP-1 細胞的細胞內化機制。 在細胞內化過程中施加在膠囊上的壓力通過評估 SIM 可視化的膠囊變形程度來量化（圖 2iv）。這項開創性工作為檢測細胞力學提供了一種實用的方法，這對于揭示細胞力學生物學和設計對細胞機械力敏感的先進材料具有重要意義。

2.2 受激發射損耗顯微鏡（STED）

STED 耗盡點擴散函數外部區域的熒光團以銳化焦點，因此將橫向和軸向的分辨率提高到 25-80 nm（圖 1）。與SIM、STED 允許更高的分辨率，不需要后數學處理，具有實時成像和快速采集的能力。例如，STED 顯微鏡成功地用于對固定和活的 MCF7 細胞中碳點的定位進行成像，與傳統的共聚焦顯微鏡相比，空間分辨率提高了 6 倍以上，低至 30 nm（圖 3i)。同樣，STED 也被應用于成像活細胞與轉鐵蛋白的相互作 用。與共焦圖像相比，納米粒子具有大約 4 倍的分辨率增強。這種 STED 不僅能夠對活細胞中這些基于蛋白質的結構進行精確成像，而且還揭示了早期內體結構內化后顆粒的富集（圖 3ii）。Kraegeloh 的小組首先應用 STED 來研究納米粒子與細胞的相互作用。他們使用 STED 確定了人結腸癌細胞 (Caco-2) 內熒光二氧化硅顆粒（直徑為 32 和 83 nm）的團聚體尺寸。與 83 nm 粒子相比，32 nm 粒子遷移的定量評估表明，更多的 32 nm 粒子被內化，并且它們遷移到細胞中的速度更快。只有 32 nm 的顆粒穿透細胞核并在 48 小時后形成 200 nm 的附聚物，72 小時后在核中形成 300 nm 的附聚物（圖 3iii）。這項工作為研究納米材料的多向性相互作用開辟了一條途徑。Kraegeloh 的小組首次進一步證明，可以通過圖像處理從整個細胞的 3D STED 圖像堆棧中提取肺上皮細胞 (A549) 內化的二氧化硅納米粒子數量的定量估計。STED 圖像在 A549 細胞攝入于直徑為 25 nm 的納米粒子5 小時后進行拍攝（圖 3iv）。

圖 3 STED 研究的納米細胞相互作用，包括納米顆粒的內吞作用機制和內化量化

2.3 隨機光學重建顯微鏡（STORM）

STORM 基于對單個隨機閃爍熒光團的準確定位，可以提供高分辨率圖像，分辨率比標準熒光顯微鏡高 數十倍。STORM 已經成功在生物學研究中完全用于發現未揭示的細胞結構。De Geest 和 Albertazzi 將 STORM 與單分子數據分析相結合，探索納米粒子進入細胞過程中的行為，提供對納米粒子相互作用的定量研究與細胞膜和隨后的吸收機制有關。值得注意的是，他們直接比較了使用 TEM、STORM 和共聚焦顯微鏡獲得的細胞內納米粒子的圖像（圖 4i）。STORM 最近還被用于納米生物相互作用的定量體外研究，其中研究人員研究了圍繞納米顆粒的蛋白冠的形成如何影響注射納米顆粒的穩定性、靶向能力和免疫原性，以發揮其治療潛力。Albertazzi 的小組證明，MSN 之間表面化學的細微初始差異可以導致異質蛋白質擴增粒子的多樣性，導致具有不同蛋白質層和不同理化性質的粒子共存（圖 4ii）。

圖4 STORM 研究的納米細胞相互作用，包括攝取機制和蛋白冠的形成

2.4 光活化定位顯微鏡（PALM）

PALM 利用光開關熒光蛋白來激活分子亞群以進行隨機順序單分子識別。活細胞 PALM 的一個有前途的應用是使用光活化來執行高密度單粒子跟蹤，克服了單粒子跟蹤的傳統限制，以與顯示非常低濃度熒光團的系統一起工作。通過使用 PALM 結合單粒子追蹤，研究了聚苯乙烯基納米粒子內吞的動態內吞過程，這允許在活細胞環境中可視化網格蛋白介導的納米粒子內吞作用。結果表明，在大多數事件中，>90% 的納米顆粒首先與細胞膜結合，隨后形成了氯氰菊酯涂層的小坑 (CCP)，而其余的納米顆粒則在細胞膜內擴散以供利用由預制的 CCP。

圖 5 PALM 研究的納米細胞相互作用，包括細胞攝取過程和細胞內定位

如圖 5i 所示，納米顆粒（紅色）首先粘附在質膜上，而網格蛋白（藍色）不可見。 然后，CCP 信號逐漸增強，表明 cla-thrin 向該站點募集。 在這 55 ± 23 秒的持續時間內，納米粒子的發射強度基本保持不變。 CCP 信號達到峰值后，納米顆粒強度開始降低。 在后期（45-75 秒），在 CCP 的 PALM 圖像和納米粒子軌跡中都觀察到了 100 nm 的橫向運動，這可能是由于納米粒子在胞內區。 雖然這項工作只關注網格蛋白介導的內吞作用，但它為研究 PALM 納米顆粒的其他內吞作用機制開辟了一條途徑。 PALM 還被用來表征和量化 10 nm 分辨率下不同剛度的 RGD 矩陣上的早期整合素簇（圖 5ii）。 結果表明，非常早期的粘連由 50 個 β3 激活的整聯蛋白的 100 nm 簇組成。 這些早期的粘連形成類似地在柔性和剛性基材上，但是大多數粘附在剛性基材上是暫時的。

02研究總結

過去的十年中，隨著超分辨率技術的整合，納米細胞相互作用中的光學顯微鏡領域經歷了復興。盡管仍然存在一些擔憂，超分辨率顯微鏡與其他熒光顯微鏡技術一樣，依賴于細胞內熒光分子的表達，通常是通過引入可直接影響細胞生理的外部基因，因此可能無法反映“真實”的納米細胞相互作用，毫無疑問，超分辨率技術的發展代表了一項重大進步，也是了解納米材料在生物領域之旅中的行為的有力工具。

以納米分辨率直接可視化納米材料的能力產生了關鍵信息，例如單個內吞事件的機制、細胞內納米粒子的追蹤以及治療有效載荷的細胞內位置。必須了解這些作用機制，才能設計出具有增強內化效率和跟蹤動力學的安全納米粒子。反過來，此類信息可用于加深對生物環境的基本了解。隨著超分辨率顯微鏡技術（例如更好的探測器和熒光探針）的不斷發展，我們已經看到該方法在空間和時間分辨率、復雜標本的可訪問性和生命系統的微創性方面的性能顯著提高。這將為研究納米細胞相互作用提供更多機會。

在本研究中， 這項2014年諾貝爾化學獎的發現已在國內實現產業化。 寧波 力顯智能科技 有限公司 (INVIEW) 現已發布超高分辨率顯微系統 iSTORM ，采用3D隨機光學重構技術、高精度細胞實時鎖定技術、多通道同時成像技術等，以 納米級觀測精度 、 高穩定性 、 廣泛環境適用 、 快速成像 、 簡易操作 等優異特性，獲得了超過50家科研小組和100多位科研人員的高度認可。

參考文獻：

1. Advances in super-resolution fluorescence microscopy for the study of nano–cell interactions

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寧波力顯智能科技有限公司（INVIEW）是專業從事超高分辨率顯微技術和產品研發的科技企業，依托復旦大學的自動控制、新一代信息技術及香港科技大學的生物、光學、圖像處理等的技術，擁有光學、生物、自控、機械、信息技術等多領域交叉學科技術團隊，將2014年諾貝爾化學獎技術產業化，推出了超高分辨率顯微產品，幫助人們以前所未有的視角觀察微觀世界，突破極限，見所未見。