文獻解讀
01研究介紹
熒光團在非熒光狀態和熒光狀態之間的受控切換在每種超分辨率熒光顯微鏡技術中都起著關鍵作用，而探索全新的切換機制對于已有的和新興的超分辨率方法性能提升仍至關重要。在該研究中，作者提出了一種將3,6-二氨基氧雜蒽酮轉化為無籠基團的光活化熒光團的通用方法?？晒饣罨膮銍嵧?(PaX) 在用光照射后能高效、清潔地轉化為高熒光、光和化學穩定的吡咯啉染料。同時，該策略也能擴展到碳和硅橋聯的蒽酮類似物，產生一系列足以覆蓋大部分可見光譜的可光活化標簽。研究結果證明了PaX染料在常規顯微鏡的固定細胞及活細胞標記中具有多功能性和實用性，以及在STED、PALM和MINFLUX的坐標隨機和確定性納米觀察中的多功能性和實用性。
熒光納米顯微鏡以個位數納米分辨率實現了對具有分子特異性的生物樣品內部結構和動力學的微創觀察，大大提升了我們觀察（活）細胞的能力。而這些技術的核心在于化學特異性熒光標記和熒光團的開-關狀態之間的內在控制。由于開關轉換不可逆的光活化染料或籠狀染料在使用時無需特定的成像緩沖液和高強度紫外線，因此，它們在單分子定位顯微技術中被廣泛使用。如今光活化染料已被用于減少DNA涂料中的熒光背景，并用于提高可通過通道疊加在受激發射損耗 (STED) 顯微鏡中同時成像的細胞結構數量。其中，羅丹明染料因其光學和化學穩定性，細胞膜滲透性和亮度的顯著可調性，已成為熒光顯微鏡和納米顯微鏡中使用得最多的熒光團之一，特別是硅羅丹明染料，因其出色的紅移發射、穩定持久的熒光信號、良好的活細胞相容性和亮度而受到青睞。
在這之前，已報道的羅丹明的籠化策略一般都是依賴于以非熒光形式“鎖定”染料，即通過在氮原子上安裝耐光保護基團(如硝基藜蘆基氧羰基或亞硝基)，或者通過內酯環合成轉化為相應的環α-重氮酮。然而，這兩種策略都存在一定的局限性，前者會降低染料的水溶性，并在光活化時產生潛在的毒副產物，而后者則會形成不同的非熒光副產物，導致主產物豐度降低。因此，在熒光顯微術和納米技術中，如果要求光活化能夠以快速的、完全的并且沒有副產物的方式進行，那么無籠基的、緊湊型光活化的以及生物相容的熒光團是非常必要的。
02研究結果和討論
1、光活化標簽的合成設計和機理
在這里，作者對反應機理做出了猜想和驗證（圖1b），PaX在受到405nm波長的光照后，由基態躍遷至激發態，與尚在基態的助劑上的孤對電子作用，使電子從助劑轉移到PaX上，之后通過烯烴上的電子轉移形成新的六元環，經過環內電子轉移后，最后經質子化形成封閉式PaX-CF。
圖1、PaX染料的設計、合成和表征
a、作者采用了一種依賴于熒光團的光誘導組裝 (“鎖定”)方法，在傳統方法中，用于納米鏡的光活化染料一般依賴于籠狀基團的釋放 (“解鎖”)。
b、具有1-烯基自由基阱及其9-烷氧基吡啶光產物 (閉合形式，CF) 的PaX的一般結構，以及所提出的光激活機理。
c、制備PaX的合成路線。
d、在磷酸鹽緩沖液（100 mM，pH 7；λact = 405 nm）中化合物1 (1.66 μg ml-1) 隨時間變化的吸收光譜和熒光光譜。
e、在與d中相同的條件下，比較硅橋PaX 1–6的光活化動力學。
f、在與d相同的條件下，比較PaX染料9-12的光活化動力學。
g、比較化合物11 (3.8 μM) 在不同pH值 (λact = 405 nm) 的磷酸鹽緩沖液 (100 mM) 中的比較光活化動力學。
h、在磷酸鹽緩沖液（λexc = 530 nm）中測量具有相似光譜特性的 11-CF 和已建立的商業熒光團的抗光疲勞性。
為了研究自由基受體取代的影響，作者合成了一系列可光活化的Si-xanthones (1-7; 圖1c)。目標產物是通過銥催化，螯合輔助，鄰位選擇的二芳基酮C-H硼化反應(A)制備的。在KF作用下，經CuBr2-吡啶體系將生成的硼酸酯(B)轉化為相應的芳基溴(C)，最后在標準 Suzuki-Miyaura 交叉偶聯反應條件下進行一系列烯烴取代。
2、用于納米鏡的無籠狀基團的光活化標簽
圖2、用于光學納米鏡的光激活標簽
a、用于生物偶聯 (13, 14) 和肌動蛋白標記 (15) 的PaX560衍生物的結構。
b、COS-7細胞中微管的STED（左）和PALM（右）圖像，用帶有13的二抗間接免疫熒光標記。
c、固定的初級海馬神經元培養物軸突中周期性膜細胞骨架的肌動蛋白結構，用15標記并置于Mowiol中。
d、通過間接免疫熒光標記的COS-7細胞中NPC的PALM圖像，用抗NUP98一抗和用 14標記的二級納米抗體。
e、表達NUP107-mEGFP的HeLa-Kyoto細胞中NPC的PALM圖像，用與14偶聯的抗GFP 納米抗體標記。
比例尺：2 μm（b-e，主圖像），500 nm（d，e插圖），50 nm（d，底部），100 nm（e，底部）。
3、用于活細胞成像的靶向標簽
圖3、在活細胞中使用可光激活PaX標簽進行成像
a、用于活細胞成像的PaX560衍生物 (19-22) 的結構。
b、COS-7 細胞與19 (200 nM) 和 MitoTracker Deep Red (50 nM，上層) 或 20 (20 nM) 和 SiR-溶酶體 (200 nM，下層)共孵育的共聚焦圖像和相應的Pearson相關分析）。使用355 nm激光實現向19-CF和20-CF的轉換。
c、U2OS細胞中波形蛋白絲在激活前（上層）和雙光子激活（2PA）（下層，箭頭所示）標記為21（200 nM）的共聚焦圖像。
d、單光子（355 nm，100% 時為0.3 μW）或雙光子激活激光器（810 nm，10%時為109 mW）的激活率與激光功率的關系圖。
e、同一樣品在405 nm激光激活后的共焦（頂層）和 STED（底層）圖像。
比例尺：5 μm (b,c)和1μm (e)。
4、通過選擇性光激活多路復用 PaX 標簽
考慮到PaX染料的光活化速率的差異，作者推測兩個互補的標簽可用于多路復用，依次應用較低和較高劑量的激活光，首先轉換一個熒光團（例如PaX560），同時保留較難激活的熒光團（例如PaX480 )，直到施加較高的光劑量。首先作者通過共焦成像測試了這一點，然后通過雙色單檢測器 PALM成像在固定的細胞中測試，用細胞器（Pax560–Mito 19或Pax560–Lyso 20）和Halotag特異性（Pax480–Halo，23）標記，通過共聚焦成像進一步證明了活細胞中的順序激活。
03研究結論
作者引進了一種無籠組、明亮和活細胞兼容的光活化染料的通用設計策略，適用于廣泛的光學顯微鏡和納米技術，包括PALM、STED和MINFLUX。這些PaX染料的獨特結構特征將光響應性3,6-二氨基呫噸酮核心與分子內烯烴自由基阱功能化，從而提供高度緊湊且本身不帶電、完整的細胞膜可滲透標記。在單光子或雙光子活化下，這些化合物迅速形成高度光穩定的熒光吡咯啉染料。通過改變PaX染料的取代基，可以改變光活化動力學以及光譜特性，從而實現多路復用偽彩色和傳統的多色成像。
在固定和活細胞超分辨率熒光顯微鏡實驗中，PaX染料的實用性和多功能性經過各種目標特異性探針和標記策略得到了證明。這種方法將會進一步刺激用于生物成像和材料科學的光活化探針和傳感器的發展。
（更多研究解讀將于后續分享）
04超高分辨率顯微成像系統iSTORM
寧波力顯智能科技有限公司(INVIEW)現已發布的超高分辨率顯微成像系統 iSTORM，采用了源自諾貝爾化學獎原理的 STORM 超高分辨率顯微成像技術, 實現了光學顯微鏡對衍射極限的突破，使得在 20 nm的分辨率尺度上從事生物大分子的單分子定位與計數、亞細胞及超分子結構解析、生物大分子生物動力學等的研究成為現實，從而給生命科學、醫學等領域帶來重大突破 。
圖4、力顯智能自主研發的超高分辨率顯微成像系統iSTORM。
超高分辨率顯微成像系統 iSTORM 具有 20 nm超高分辨率、3通道同時成像、3D同步拍攝、實時重構、2小時新手掌握等特點，已實現活細胞單分子定位與計數，并提供熒光染料選擇、樣本制備、成像服務與實驗方案整體解決方案， 以納米級觀測精度、高穩定性、廣泛環境適用、快速成像、簡易操作等優異特性，獲得了超過50家科研小組和100多位科研人員的高度認可。
參考文獻：
Lincoln, R., Bossi, M.L., Remmel, M. et al. A general design of caging-group-free photoactivatable fluorophores for live-cell nanoscopy. Nat. Chem. (2022).
