01研究背景
端粒是位于染色體末端的保護性結構，是在哺乳動物中由(TTAGGG)n和相關蛋白的混合物組成的串聯重復DNA序列。端粒在許多細胞過程中起著保護染色體免受降解、激活復制衰老和調節基因表達等重要作用。
在體細胞中，端粒脫保護觸發DNA損傷反應和端粒介導的復制性衰老，可以被視為阻止正常老化細胞增殖的內在過程。端粒也會導致干細胞的耗竭和健康細胞更新的喪失、組織再生缺陷、組織功能下降、衰老細胞積累等。而衰老細胞在組織中的積聚被認為是長期慢性炎癥和與年齡相關的疾病（包括癌癥）的主要原因。生物年齡是許多慢性疾病發病率的主要預測因素。在正常細胞衰老過程中，端粒完整性的喪失也會引發DNA損傷信號，最終導致衰老表型。
熒光顯微鏡有助于研究人員研究端粒的動力學、形狀、定位和蛋白質的共分布。研究這些結構的顯微鏡工具目前已發展到能夠對影響端粒的分子機制進行探究。作者以人類成纖維細胞為例，利用多種顯微鏡，以及兩種超分辨率技術，即三維結構照明顯微鏡(3D-SIM)和直接隨機光學重建顯微鏡（dSTORM）來研究端粒的幾個特征。在本文中，重點介紹直接隨機光學重建顯微鏡（dSTORM）對于端粒研究的益處。
02研究介紹（節選）
一、端粒可視化
深入了解維持端粒完整性所涉及的途徑和蛋白質，對于提高細胞壽命和延緩年齡相關疾病發病至關重要。大約25年前，端粒DNA首次被熒光顯微鏡觀察到，只是那時候顯微技術的分辨率還有待提高。大約150年前，恩斯特·阿貝首先描述了分辨率極限，它被定義為兩個物體之間的最短距離（在這個距離上，它們可以被區分為兩個獨立的實體）。對于遠場熒光顯微鏡，光學分辨率由光波長和物鏡的數值孔徑決定。
此外，細胞特征和背景之間的反差會降低圖像的分辨率，要求研究人員使用明亮的探針。雖然在熒光顯微鏡中，樣品中的對比度通常不是唯一因素，但分辨率在物理上受到光的衍射的限制，其橫向(X，Y)分辨率為200-250納米，軸向(Z)分辨率為500-700納米。為了突破衍射極限，需要在橫向、軸向或兩者同時提高兩倍或更多的分辨率，目前已經開發了各種技術。
可視化、分析和定量單個端粒的首選技術之一是將端粒上發現的TTAGGG序列與熒光標記肽核酸(PNA)探針直接雜交。這種被稱為熒光原位雜交(FISH)的技術，可以用來測定中期擴散的端粒長度，因為更多的串聯端粒序列（即更長的端粒）允許更多的PNA分子結合，因此可以看到更亮的“斑點”。為了說明FISH的應用，作者對衰老前成纖維細胞進行中期擴散，并用Alexa Fluor488結合PNA探針染色端粒DNA。
圖1、衰老成纖維細胞端粒熒光原位雜交、BJ成纖維細胞染色體畸變的圖像。
（A）一個有46條染色體的衰老前期BJ細胞的中期擴散，DNA用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚/DAPI（藍色）和端粒用PNA Telc-488探針（綠色）染色。
（B）白色箭頭代表脆弱的端?；蚨肆６伢w
（C）姐妹端粒丟失導致短端粒
（D）姐妹染色單體上的無信號端
（E）間質端粒序列和姐妹端粒丟失導致一個無信號端。
作者觀察了預期的46條染色體，大多數染色體末端含有可檢測到的端粒染色。將FISH應用于中期擴散對于確定染色體畸變（包括含有無信號末端的染色體）是很重要的。在這種情況下，端粒太短則不能被PNA探針識別，熒光信號太暗則不能在圖像采集期間被檢測器讀取。對無信號末端的存在，可以進行估計，可估計有多少極短的染色體或可能沒有端粒DNA。
SIM和STED可以通過控制照明光來提高分辨率，SMLM技術只記錄每張圖像中熒光團總數的稀疏子集，以實現20-50納米的成像分辨率。即使成像分子表現為衍射限制點，只要它們彼此相距至少200納米就可以通過擬合和質心查找來確定它們的準確定位。超分辨率顯微鏡和優化的成像技術顯著提高了對端粒生物學的理解。由于端粒在間期細胞內的半徑低于衍射限制分辨率，通常為60-100納米，因此利用超分辨率技術來研究端粒的大小和形狀越來越受到人們的關注。
二、構建端粒形狀
直接隨機光學重建顯微鏡（dSTORM）通過熒光染料的“閃爍”操作，利用單個熒光團的時間分離來工作，即在任何一個時間只記錄來自稀疏的單個熒光團集的發射，再經過擬合和質心查找，將獲取的圖像序列轉換為高分辨率圖像。通常是使用Alexa Fluor647（Thermo Fisher Scientificial），意味著單個Alexa Fluor647分子經歷了開-關（亮-暗）循環，在每次采集視場中只有約1%的熒光團發射光，利用Alexa Fluor647共軛PNA探針染色，將樣品浸入氧清除緩沖液中以促進光開關并多次循環重復，獲取時間序列后，利用高斯擬合可以重建超分辨率圖像，以此來實現20-30納米的橫向分辨率。
超分辨率技術dSTORM最初被用于可視化來自不同類型細胞的端粒的非環結構。早期的電子顯微鏡顯示，端粒DNA的物理末端會折疊并置換一條DNA鏈，形成所謂的T環結構。另外的研究表明，這種重要的結構在特定的防護蛋白缺失時會丟失，導致DNA損傷反應的激活。這些研究表明，dSTORM是一種非常強大的技術，可以準確地顯示T環的結構。
作者計算、重構和可視化了dSTORM的數據，在分析點云的單個大小和形狀時，發現端粒是極其不均勻的，并不總是以球形結構出現。例如，它們可能在一個維度上被拉長，形成一個更橢圓形或矩形的形狀，或者非常不規則。當對BJ細胞中的單個點云進行三維可視化時，作者還觀察到了各種不同的形狀。當觀察到球形端粒，作者經常發現不規則的異構結構，這為端粒區域的性質提供線索。這些圖像顯示了BJ成纖維細胞端粒DNA的不同三維排列，證實了3D-STORM是研究端粒形狀的合適技術。
圖2、3D-STORM測定端粒形狀的變異性。
（A)一個二維寬視場快照的例子，一個表示3D的像散寬視場快照，重構3D- STORM數據的最大強度投影，以及PNA TelC-647探針染色的BJ成纖維細胞的覆蓋圖像。比例尺=5 μm。
（B) NEO SAFe軟件中單個本地化的可視化。每個點代表一個分子，使用DBSCAN將它們分組成簇。不同的顏色代表z位置。
比例尺= 4 μm，其中紅色= x軸，綠色= y軸，藍色= z軸。識別出各種不同的形狀，包括球形(C)、不規則(D)和橋狀結構(E)。標尺桿= 50 nm，其中紅色= x軸，綠色= y軸，藍色= z軸。
三、測量端粒大小
由于3D-STORM的橫向分辨率為20-30納米，軸向分辨率為50-70納米，因此可以用來測量端粒大小。根據SMLM成像，端粒大小的一個常見讀數是回轉半徑，即每個單個分子到分子云質心位置（質心）的均方根距離。然而，由分子云的最外層點確定的端粒體積也可以作為尺寸的讀出值。利用這些測量，研究小組試圖計算端粒密度或壓實，它代表一定體積內端粒DNA的數量，以探索端粒DNA是如何包裝的。然而，Alexa Fluor647的光開關特性使得在dSTORM采集過程中，一個Alexa Fluor647分子可以被多次檢測。因此，雖然短端粒平均來說比長端粒有更少的開關周期，長端粒含有更多的PNA探針，但一個定位并不等于一個Alexa Fluor647分子。這使得很難根據定位的數量和大小來提取密度測量值。一種可能是根據每個端粒焦點的定位數量來繪制體積，放松會導致更垂直的繪制線路。然而，如果PNA探針雜交受到端粒致密狀態的影響，其密度可能被低估。另一個需要注意的特點是3D-STORM有一個有限的Z深度，通常在800-1000納米左右。因此，為了覆蓋整個核，需要在多個焦平面上進行三維STORM成像，并進行折射率校正。盡管勞動強度很大，這項技術揭示了線粒體和微管之間的新的相互作用，并可能對端粒與核膜的相互作用提供更多的見解。它對于T環的可視化和單個短端粒的尺寸測量非常強大，超出了3D-SIM所能實現的范圍。
圖3、通過不同的方法，將端粒的大小與寬視場、3D-SIM和dSTORM顯微鏡技術所能分辨的最小體積進行比較。
03超高分辨顯微成像系統iSTORM
傳統的顯微鏡技術使了解端粒生物學基礎成為可能，但端粒的納米級研究還確實需要隨機光學重建顯微鏡STORM等超分辨率顯微鏡。目前，在國內，隨機光學重建顯微鏡STORM已成功實現商用。現已發布的超高分辨率顯微成像系統 iSTORM，成功實現了光學顯微鏡對衍射極限的突破，使得在 20納米的分辨率尺度上從事生物大分子的單分子定位與計數、亞細胞及超分子結構解析、生物大分子生物動力學等的研究成為現實，從而給生命科學、醫學等領域帶來重大突破 。
超高分辨率顯微成像系統 iSTORM 具有 20 納米超高分辨率、3通道同時成像、3D同步拍攝、實時重構、2小時新手掌握 等特點，并提供熒光染料選擇、樣本制備、成像服務與實驗方案整體解決方案， 以納米級觀測精度、高穩定性、廣泛環境適用、快速成像、簡易操作等優異特性，獲得高度認可！
參考文獻
Adam N, Beattie TL, Riabowol K. Fluorescence microscopy methods for examining telomeres during cell aging. Ageing Res Rev. 2021 Jul;68:101320. doi: 10.1016/j.arr.2021.101320. Epub 2021 Mar 17. PMID: 33744488.
